УДК 578.834.1
DOI 10.64831/2619-0001.2020.2.101318
А.Е. Донников, к.м.н., Е.С. Шубина, к.б.н.
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения РФ, г. Москва, Россия
РЕЗЮМЕ. Необходимость контроля за новой коронавирусной инфекцией привела к существенному расширению объема тестирования. Цель настоящего исследования — анализ выявляемости РНК SARS-CoV-2 при скрининге на COVID-19 у различных групп населения. Был проведен ретроспективный анализ 93 570 исследований методом ПЦР с обратной транскрипцией, в том числе 1609 исследований у пациентов специализированного инфекционного госпиталя. Показано, что необходимо использовать тест-системы для определения РНК SARS-CoV-2 с максимальной чувствительностью для выявления низкокопийных образцов, составляющих значительную часть всех положительных результатов. В то же время наличие образцов с очень высокой концентрацией вируса требует тщательного соблюдения мер по предотвращению кросс-контаминации. Короткий межскрининговый интервал в совокупности с другими противоэпидемическими мероприятиями позволяет существенно улучшить эпидемиологическую ситуацию внутри лечебного учреждения.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: COVID-19, SARS-COV-2, СКРИНИНГ, БЕССИМПТОМНЫЕ НОСИТЕЛИ, ВИРУСНАЯ НАГРУЗКА, ПЦР
ДЛЯ ЦИТИРОВАНИЯ: Донников А.Е., Шубина Е.С. Опыт организации ПЦР-скрининга на новую коронавирусную инфекцию COVID-19. Медицинский оппонент 2020; 2 (10): 13—18.
UDC 578.834.1
A.E. Donnikov, E.S. Shubina
FSBI «National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov» Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia
SUMMARY. The need to control a new coronavirus infection has led to a significant increase in the number of tests. The purpose of this study was to analyze the results of detection of SARS-CoV-2 RNA during screening for a new coronavirus infection in various population groups. A retrospective analysis of 93 570 reverse transcription PCR tests were performed, including 1609 studies from patients of a specialized infectious diseases hospital. It is shown that it is necessary to use test systems for determining SARS-CoV-2 RNA with maximum sensitivity for detecting samples with low viral load, that make up a significant part of all positive results. At the same time, the presence of samples with a very high concentration of the virus requires careful compliance with measures to prevent cross-contamination. A short inter-screening interval in combination with other anti-epidemic measures can significantly improve the epidemiological situation in the hospital.
KEYWORDS: COVID-19, SARS-COV-2, SCREENING, ASYMPTOMATIC CARRIER, VIRAL LOAD, PCR
FOR CITATION: Donnikov A.E., Shubina E.S. Experience in organizing PCR screening for the new coronavirus infection COVID-19. Meditsinskiy Opponent = Medical Opponent 2020; 2 (10): 13—18.
Коронавирусы (Coronaviridae) представляют собой семейство РНК-содержащих оболочечных вирусов, которые впервые были описаны в 1966 году Tyrell и Bynoe как возбудители острых респираторных инфекций. Включают в себя четыре рода (альфа, бета, гамма, дельта) и около 40 видов. Патогенными для человека являются всего лишь семь видов, из которых два относятся к роду альфа-коронавирусов (hCoV E229 и hCoV NL63) и пять — к бета-коронавирусам (hCoV OC43, hCoV HKU1, SARS-CoV, MERS-CoV и новый SARS-CoV-2). Наибольшей вирулентностью обладают бета-коронавирусы (SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2). Ранее уже были зарегистрированы вспышки инфекции, вызванной SARS-CoV (2003) и MERS-CoV (2013), сопровождавшиеся развитием тяжелого острого респираторного синдрома и пневмонии. Однако распространение нового вируса SARS-CoV-2 и вызываемого им заболевания COVID-19 (Coronavirus disease 2019) приобрело пандемический характер [1]. За время от начала появления первых случаев заболевания (ноябрь 2019 года, г. Ухань, Китай) до настоящего момента накоплено большое число наблюдений реализации и особенностей течения заболевания среди пациентов различных возрастных групп как в Китае, так и за его пределами. Хотя большинство случаев инфекции протекает без осложнений, у 5–10% пациентов развивается пневмония с тяжелой дыхательной и полиорганной недостаточностью, требующая госпитализации [2].
В качестве основного метода диагностики и скрининга рекомендовано определение РНК вируса SARS-CoV-2 методом ПЦР с обратной транскрипцией. Необходимость контроля за новой коронавирусной инфекцией привела к существенному расширению объема тестирования. Так, в нашей лаборатории в период эпидемии COVID-19 ежедневно выполнялось в 2–3 раза больше исследований на наличие SARS-CoV-2, чем на все вирусные респираторные инфекции за весь предыдущий год.
Это позволило накопить большой объем статистических данных, позволяющих лучше понять эпидемиологию и особенности лабораторной диагностики не только COVID-19, но и других респираторных инфекций.
Цель настоящего исследования — анализ выявляемости РНК SARS-CoV-2 при скрининге на новую коронавирусную инфекцию у различных групп населения для оптимизации лабораторной диагностики.
В статье представлен ретроспективный анализ базы данных результатов исследования на новую коронавирусную инфекцию COVID-19 лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения РФ (далее — Центр) за период с 1 апреля по 12 сентября 2020 года. Было выполнено 93 570 исследований, в том числе 1609 исследований у пациентов специализированного инфекционного госпиталя, развернутого на территории Центра.
Все исследования проводились с помощью набора реагентов для выявления РНК коронавирусов SARS-CoV-2 (и подобных SARS-CoV) методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (SARS-CoV-2/SARS-CoV) (РУ № РЗН 2020/9948 от 01.01.2020) производства ООО «ДНК-Технология» (Россия). Чувствительность системы составляла 500 копий вируса на миллилитр образца. Особенностью данного метода является определение одновременно трех мишеней по каналам детекции Fam/Green, Rox/Orange и Cy5/Red для повышения надежности диагностики, поскольку нельзя исключить возникновения новых мутаций в геноме коронавируса. В качестве мишеней выбраны три участка генома вируса: специфичные для коронавируса SARS-CoV-2 участки гена N и гена E, а также консервативный участок гена E, общий для группы коронавирусов, подобных SARS-CoV, включая SARS-CoV и SARS-CoV-2. Данная тест-система получила признание Европейской комиссии [3].
В случае необходимости для подтверждения результата использовали набор реагентов для выявления РНК коронавирусов SARS-CoV-2 тяжелого острого респираторного синдрома (COVID-19) методом полимеразной цепной реакции «АмплиТест SARS-CoV-2» (РУ № РЗН 2020/9765 от 27.03.2020) производства ФГБУ «ЦСП» Министерства РФ (Россия).
Обе тест-системы являются качественными, тем не менее для положительных результатов был проведен анализ порогового цикла (Ср) для приблизительной оценки количества вируса в исследуемом биоматериале.
Среди обследованных можно условно выделить три группы, различающиеся по частоте тестирования. Это пациенты, однократно обследуемые перед госпитализацией или в случае возникновения клинических симптомов инфекции; сотрудники Центра, проходящие регулярный скрининг на наличие SARS-CoV-2; персонал других организаций, регулярно обследуемый с разной периодичностью.
Выделение РНК проводили в автоматическом режиме на дозирующей станции «ДТстрим» (РУ № РЗН 2015/2982 от 01.04.2019) с использованием комплекта реагентов «ПРОБА-НК-МЧ» (РУ № РЗН 2017/5753 от 23.06.2020) и вручную — с применением комплектов реагентов «ПРОБА-НК» (РУ № ФСР 2010/08867 от 13.10.2016) и «ПРОБА-НК-S» (РУ № РЗН 2020/11296 от 10.07.2020) производства ООО «ДНК-Технология» (Россия).
Особенности организации скрининга. Для обеспечения противоэпидемических мероприятий все пациенты перед госпитализацией проходили тестирование на COVID-19, в связи с чем практически сразу в лаборатории была организована круглосуточная работа. При этом часто женщины нуждались в экстренной помощи, поэтому в лаборатории создали группу срочного тестирования, что позволило в кратчайшие сроки получать ответ о наличии вируса SARS-CoV-2. Эта группа была отделена от основного потока исследований и использовала ускоренные методики выделения РНК. Доля срочных тестирований в связи с госпитализацией колебалась в зависимости от общего потока и в среднем составила 6%. Также срочные исследования проводились при появлении симптомов, характерных для коронавирусной инфекции, поэтому их суммарная доля в общем потоке за анализируемый период составила 14,5%. К сожалению, особенности технологического процесса не позволяют сократить время тестирования (необходимый минимум — 3–3,5 часа), поэтому в клинике должна быть обеспечена возможность оказания помощи поступающим пациентам до получения информации об их инфекционном статусе с соблюдением всех противоэпидемических требований.
Структура обследованного контингента представлена на рис. 1. Большая часть исследований выполнялась в рамках периодического скрининга как сотрудников Центра, так и персонала других организаций.
Диапазон вирусной нагрузки SARS-CoV-2. Количество вирусных частиц SARS-CoV-2 может варьировать в широких пределах от очень низких значений (несколько сотен в мл) до крайне высоких (более 10⁹ коп/мл). В связи с потенциальной возможностью наличия высококопийных образцов при выполнении исследований в клинической лаборатории серьезную опасность представляет риск кросс-контаминации между образцами на всех этапах работы, особенно при аликвотировании и выделении РНК. Перекрестная контаминация высококопийным биоматериалом может приводить к появлению ложноположительных результатов. Обычно такие результаты располагаются рядом с высококопийными образцами при выделении РНК или заполнении амплификационных пробирок и характеризуются меньшей вирусной нагрузкой (более высокие значения Ср).
При этом выявление образцов с крайне низкой вирусной нагрузкой (в районе предела (и даже ниже) обнаружения используемой нами тест-системы) ни в коем случае не должно быть проигнорировано. Мы неоднократно наблюдали развитие инфекционного процесса, когда у пациента после выявления низкокопийного положительного результата буквально через сутки вирусная нагрузка достигала значений 10⁶–10⁸ коп/мл и появлялись признаки поражения легких, требующие немедленной госпитализации. Поэтому говорить о чрезмерной чувствительности ПЦР [4, 5] при диагностике COVID-19 ни в коем случае нельзя.
Наш опыт свидетельствует, что, помимо строгого соблюдения всех рекомендаций, направленных на предотвращение кросс-контаминации, все положительные образцы должны быть проверены повторным тестированием (начиная как минимум с этапа выделения РНК). Крайне желательным является повторный отбор биоматериала, особенно в случае низкокопийного результата. При этом вследствие крайне малого содержания вируса возможен феномен «мигающих результатов», когда положительный результат определяется стохастической вероятностью попадания единичных копий нуклеиновых кислот в амплификационную пробирку. Учитывая клиническую значимость выявления вируса SARS-CoV-2, рекомендуется пристальное динамическое наблюдение за пациентами, у которых впервые получен низкокопийный положительный результат даже при отсутствии клинических симптомов.
Проблема низкокопийных образцов стоит достаточно остро [4]. По нашим данным, эти образцы могут составлять до половины всех положительных результатов (рис. 2). При этом чувствительность ряда тест-систем, используемых в России, не позволяет обнаружить таких пациентов. С одной стороны, это ограничивает возможность ранней диагностики COVID-19, с другой — ставит в двусмысленное положение лабораторию, располагающую высокочувствительными диагностикумами, т. к. такие результаты не подтверждаются референс-центрами или при тестировании в другой лаборатории. Наши наблюдения свидетельствуют, что в ряде случаев вирус может персистировать в организме в течение длительного времени. Как правило, это происходит при легком бессимптомном течении инфекции. Единственным свидетельством наличия вируса в организме являются множественные низкокопийные положительные результаты, получаемые при динамическом наблюдении. Бессимптомные носители инфекции SARS-CoV-2 вызывают большую озабоченность во всем мире [6, 7]. Является ли бессимптомный период частью естественного течения COVID-19 или хроническим состоянием? Выявляя бессимптомного носителя, важно понимать: либо он находится в инкубационном периоде или субклинической стадии инфекции, и в ближайшее время нужно ожидать появления симптомов COVID-19, или же это хронический бессимптомный носитель вируса SARS-CoV-2. Китайские авторы считают, что о хроническом носительстве можно говорить после трех недель персистирования вируса [6]. Среди 328 пациентов исследователи не отметили ни одного такого случая. У одной из сотрудниц Центра после первичного выявления вируса в рамках рутинного скрининга низкокопийный положительный результат стабильно фиксировался на протяжении 21 дня. При этом, несмотря на то что первый результат свидетельствовал о высокой вирусной нагрузке (около 10⁶ коп/мл), никаких клинических проявлений заболевания за весь период наблюдения зафиксировано не было. И если вопрос инфекционной опасности человека с таким низким содержанием вируса в организме является дискутабельным [6], то при обследовании пациентов инфекционного стационара эта проблема встает достаточно остро.
Обследование пациентов инфекционного стационара. С момента открытия инфекционного стационара на территории Центра биоматериал пациентов был выделен в отдельный поток, что позволило провести детальный анализ на уровне лаборатории. Прежде всего обращало на себя внимание достаточно низкое содержание вируса в таком биоматериале. Безусловно, связь вирусной нагрузки и особенностей течения заболевания требует более детального анализа с привлечением дополнительных клинических данных. Тем не менее можно сказать, что высокая вирусная нагрузка не служит индикатором тяжести состояния больного.
Очень часто вирусная нагрузка у бессимптомных носителей (особенно в начале заболевания) на несколько порядков превышала таковую у пациентов инфекционного стационара с выраженным повреждением легочной ткани.
Примечательно, что американские авторы сообщают об отсутствии значимых различий в величине вирусной нагрузки у симптомных и бессимптомных пациентов [8]. Имеющиеся клинические рекомендации учитывают эти особенности, никак не модифицируя тактику ведения пациента в зависимости от величины вирусной нагрузки. Однако одним из критериев выписки из стационара является получение двух отрицательных лабораторных результатов. На практике в ряде случаев это приводит к необоснованной задержке выписки людей, которые по своему состоянию не требуют более нахождения в клинике, но длительное время сохраняют вирус в организме. Так, у одного из пациентов инфекционного стационара в течение месяца стабильно выявляли вирус в малых количествах. При этом до 20% людей, которые были госпитализированы в инфекционный госпиталь, исходно не имели вируса SARS-CoV-2. Таким образом, если основанием для госпитализации является тяжесть состояния, почему при выписке оцениваются другие критерии?
Частота проведения скрининга. Учитывая высокую контагиозность и скорость развития новой коронавирусной инфекции, а также большое количество бессимптомных носителей, очевидно, что ПЦР-скрининг в сочетании с противоэпидемическими мероприятиями является эффективным инструментом профилактики заболевания.
После организации в Центре регулярного скрининга сотрудников в достаточно короткое время удалось снизить количество вновь выявляемых случаев заболевания (рис. 3). Уже за первую неделю регулярного тестирования доля положительных результатов среди персонала снизилась с 3,7 до 2,3%, а через четыре недели не превышала 1%. При этом большинство сотрудников регулярно обследовались — не реже двух раз в неделю. Есть основания полагать, что своевременное выявление инфицированных работников позволяло вовремя изолировать их и предотвратить распространение инфекции в коллективе (большинство новых случаев COVID-19 обусловлено заносом инфекции извне). Примечательно, что для других организаций с аналогичной частотой скрининга, обследовавших своих сотрудников в нашей лаборатории, доля новых случаев инфекции также не превышала 1% за аналогичный период. В то же время в учреждении, обследовавшем персонал раз в две недели, выявляемость SARS-CoV-2 колебалась от 2,4 до 6,5%.
Приведенные цифры характерны для разгара эпидемии, когда в стране регистрировалось большое количество случаев заболевания. Сегодня мы не наблюдаем такой жесткой связи между выявляемостью инфекции и частотой обследования, что, по-видимому, объясняется снижением распространения вируса в популяции.
Таким образом, ПЦР-лаборатория, проводящая исследования на SARS-CoV-2, является важной составляющей комплекса противоэпидемических мероприятий в лечебном учреждении. Тест-системы, используемые для определения РНК SARS-CoV-2, должны иметь максимальную чувствительность для выявления низкокопийных образцов, составляющих значительную часть всех положительных результатов. В то же время наличие образцов с очень высокой концентрацией вируса требует тщательного соблюдения мер по предотвращению кросс-контаминации на всех этапах исследования — от взятия биоматериала до внесения РНК в амплификационную пробирку.
Для своевременной диагностики необходимо выделение в составе лаборатории группы, проводящей тестирования в срочном режиме. В то же время лабораторные мощности должны обеспечивать возможность проведения большого объема исследований для регулярного скрининга сотрудников. Короткий межскрининговый интервал в совокупности с другими противоэпидемическими мероприятиями позволяет существенно улучшить эпидемиологическую ситуацию внутри лечебного учреждения.
Гебрейесус Т.А. Вступительное слово генерального директора ВОЗ на пресс-брифинге по COVID-19 11 марта 2020 г. [Электронный ресурс.] URL: https://www.who.int/ru/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19—11-march-2020 (дата обращения: 15.09.2020). [Gebreyesus T.A. WHO Director-General’s opening remarks at the media briefing on COVID-19. 11 March, 2020. [Electronic source.] URL: https://www.who.int/ru/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19—11-March-2020 (access date: 09/15/2020). (In Russ.)].
Salzberger B., Buder F., Lampl B. et al. Epidemiologie von SARS-CoV-2-Infektion und COVID-19. Der Internist 2020; 61 (8): 782–788.
COVID-19 In Vitro Diagnostic Devices and Test Methods Database. [Electronic source.] URL: https://covid-19-diagnostics.jrc.ec.europa.eu/devices/detail/1109 (access date: 15.09.2020).
Milano J. Your Coronavirus Test Is Positive. Maybe It Shouldn’t Be. [Electronic source.] Published Aug. 29, 2020. Updated Sept. 9, 2020. URL: https://www.nytimes.com/2020/08/29/health/coronavirus-testing.html (access date: 15.09.2020).
Пандемия спустя полгода. Повторные заражения, плохие тесты и новый карантин. [Электронный ресурс.] URL: https://www.svoboda.org/a/30827486.html (дата обращения: 15.09.2020). [Pandemic six months later. Re-infections, bad quality tests, and a new quarantine. [Electronic source.] URL: https://www.svoboda.org/a/30827486.html (access date: 15.09.2020). (In Russ.)].
Zhou X., Li Y., Li T., Zhang W. Follow-up of asymptomatic patients with SARS-CoV-2 infection. Clinical Microbiology and Infection. 2020; 26 (7): 957–959.
Kimball A., Hatfield K.M., Arons M. Asymptomatic and Presymptomatic SARS-CoV-2 Infections in Residents of a Long-Term Care Skilled Nursing Facility — King County, Washington, March 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report 2020; 69 (13): 377–381.
Corcorran M.A., Olin S., Rani G. et al. Prolonged persistence of PCR-detectable virus during an outbreak of SARS-CoV-2 in an inpatient geriatric psychiatry unit in King County, Washington. American Journal of Infection Control. 2020 Aug. 19; S. S0196–6553(20)30806–3.
Вклад авторов. А.Е. Донников — концепция исследования, сбор материала, подготовка текста рукописи; Е.С. Шубина — сбор материала, статистическая обработка, редактирование текста рукописи.
Authors contributions. A.E. Donnikov — development of the research concept, data collection, article writing; E.S. Shubina — collecting data, statistical processing, editing.
Финансирование. Исследование проведено без спонсорской поддержки. Financing. The study was performed without external funding.
Статья поступила: 12.09.2020 Принята к публикации: 15.09.2020. Article received: 12.09.2020. Accepted for publication: 15.09.2020.
Донников Андрей Евгеньевич, к.м.н., заведующий лабораторией молекулярно-генетических методов ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения РФ. Адрес: 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: +7 (495) 433-27-72. E-mail: info@oparina4.ru. ORCID: 0000-0003-3504-2406.
Шубина Екатерина Сергеевна, к.б.н., заведующая лабораторией анализа геномных данных ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения РФ. Адрес: 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: +7 (495) 433-27-72. E-mail: info@oparina4.ru. ORCID: 0000-0003-4383-7428.
Donnikov Andrey Evgenievich, PhD, Molecular-genetic Laboratory Chief at the Federal State Budget Institution «National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov» of Ministry of Healthcare of Russian Federation. Address: 117997, Russia, Moscow, 4, Akademika Oparina St. Phone: +7 (495) 433-27-72. E-mail: info@oparina4.ru. ORCID: 0000-0003-3504-2406.
Shubina Jekaterina Sergeevna, PhD, Head of the Laboratory for the Genome Analysis at the Federal State Budget Institution «National Medical Research Center for Obstetrics Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov» of Ministry of Healthcare of Russia. Address: 117997, Russia, Moscow, 4, Akademika Oparina St. Phone: +7 (495) 433-27-72. E-mail: info@oparina4.ru. ORCID: 0000-0003-4383-7428.